Flash纯化时，什么时候需要使用ELSD（蒸发光散射检测器）？
Flash快速色谱看似简单，但其实可能很复杂。溶剂选择、色谱柱大小、固定相、载样技术、梯度方法、流速和……...
Flash紫外聚焦检测技术-解决信号弱样品的检测收集问题
图1. 硬脂酸甲酯结构。
图2. 在Isolera系统上显示的硬脂酸甲酯的紫外光谱。完全饱和分子的羰基对紫外线的吸收很差，波长在205纳米左右。
图3. 胆固醇结构。
图4. Isolera系统显示：胆固醇的紫外光谱在200纳米处有一个紫外值，但吸收很少。纯化方法比较简单，在100%甲醇中，使用12克Biotage SNAP Ultra C18 色谱柱，流速25ml/min。为了便于检测，我选择了200nm和205nm两种单独的波长，以及Biotage Isolera Spektra Flash系统提供的全波长功能。全波长功能使Isolera能够使用所有的二极管来检测在所有选定波长上吸收的任何紫外线能量。该系统的波长范围是200nm到400nm，这个范围内的任何紫外线吸收实际上是叠加的，总吸收量除以所选波长的数量(有助于保持非常强的吸收量比例)。对于这些吸收少的化合物，由于总的吸收是200个波长的平均值，因此利用整个200-400nm的波长范围是无效的。但话说回来，使用200nm和205nm的单一波长也是无效的(图5所示)。在200nm处，未检测到硬脂酸甲酯，因此也未收集。检测到胆固醇，但其信号强度低于200 mAU，这意味着将浪费掉大量的化合物。
图5. 硬脂酸甲酯(峰值约为4CV)和胆固醇(峰值约为8CV)混合物的Flash纯化，检测设置为200nm(红色)、205nm(黑色)和全波长(200-400nm，棕褐色)。绿色的峰值是DCM——样品的溶解溶剂。尽管这些化合物的紫外光波长为200nm，但几乎检测不到硬脂酸甲酯，因此没有收集。相反的，根据被提纯的化合物的波长范围来定制检测波长是有意义的。在这种情况下，这两种化合物在一个狭窄的波段(200至220nm)吸收紫外线，但在200至210nm之间的吸收强。为了显示波长聚焦的有效性，我重复了纯化过程。但为了加强检测，我将所有波长范围设定为200-210nm，如图6所示。
图6. 波长聚焦对硬脂酸甲酯和胆固醇的检测灵敏度的影响。将200nm(红色)和205nm(黑色)的特定波长以及200-210nm(棕褐色)之间的聚焦范围用于检测。设定特定的聚焦范围为紫外吸收差的样品提供了更好的灵敏度，允许检测和收集更多的各种化合物。如您所见，使用波长聚焦大大改善了化合物检测。在以前没有收集到硬脂酸甲酯的地方，即使在单一波长下，使用200-210nm的聚焦波长范围也可以检测和收集更多的化合物。胆固醇的紫外线吸光度也增加了——大约比单一波长(200nm)增加了5至6倍。这种波长聚焦技术的好处是可以收集更多的化合物，减少浪费。如果考虑到这一点，你会意识到这是一种很好的技术，不仅可以检测这些脂肪化合物，还可以检测多肽和其他几乎紫外信号弱的各种样品。/文：Biotage
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